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电话:0731-84321919

传真:0731-85160101

Q Q:372403785、3504420063

邮箱:jingkebio@163.com

  1.测序方案

  1.1 总RNA提取

  1.2 连接3'RNA接头

  1.3 连接5'RNA接头

  1.4 RT-PCR

  1.5 纯化Small RNA文库

  1.6 上机测序

 

  2.生物信息学分析

  2.1原始数据处理

  原始数据:测序得到的原始图像数据经 base calling 转化为序列数据,我们称之为 raw data 或 raw reads。fastq 文件为用户得到的最原始文件,里面存储 reads 的序列以及 reads 的测序质量。

  2.2数据处理及长度分布

  得到原始的fq数据后,我们会对其进行去接头,去低质量reads,去污染等处理,得到干净的序列(clean reads)。然后统计小RNA(sRNA)的种类(用unique表示)及数量(用total表示),并对小RNA做长度分布统计,一般来说,小RNA的长度区间为18~30nt,长度分布的峰能帮助我们判断小RNA的种类,如miRNA集中在21或22nt,siRNA集中在24nt,piRNA集中在30nt。

  2.3数据处理步骤

  1) 去除测序质量较低的reads(测序质量值小于20)

  2) 去除没有插入片段的reads

  3) 去除含有N值的reads

  4) 去除小于18nt的小片段

  5) 统计小RNA片段的长度分布

 

 

  2.4重复序列合并

  将序列中所有完全相同的序列合并,得到唯一序列(unique seq),减少数据量便于后续分析。并统计样品间公共序列和特有序列的种类(用unique表示)及其代表的实际序列数量(用total表示)分布情况。

  2.5与Rfam数据库对比

  选取Rfam数据库来注释测序得到的小RNA序列,尽可能的发现并去除其中可能的rRNA, scRNA, snoRNA, snRNA, tRNA等序列。

  2.6已知miRNA 表达分析

  将去除rRNA, scRNA, snoRNA, snRNA, tRNA等序列后的序列与miRNA数据库

  2.7 miRNA预测及表达分析

  miRNA前体的标志性发夹结构,能够用来预测新的miRNA。通过对截取一定长度sRNA比对上的基因组序列,探寻其二级结构及Dicer酶切位点信息、能量等特征。本次分析将之前比对到rfam非miRNA序列的序列去除,剩下序列与基因组序列比对,根据以上特征使用miRDeep2预测出miRNA区域。

  1) 从mirbase提取哺乳动物miRNA成熟体及前体序列

  2) 与Myotis lucifugus基因组比对预测新miRNA

  3) 与Pteropus_vampyrus基因组比对预测新miRNA

  2.8 miRNA及其余sRNA与哺乳动物已知miRNA比对

  1) 预测出的miRNA与哺乳动物miRNA前体对比

  2) 剩余sRNA与哺乳动物miRNA前体对比

  3) 与基因组比对

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